Introducere în genomica. Genomul uman, principalele caracteristici ale organizării

1. Genomul, clonarea, originile umane. – Ed. L.I. Korochkina. – Fryazino: „Vek 2”, 2004. – 224 p.

2. Animale și păsări dispărute care sunt cel mai ușor de clonat. - Resursa electronica. – 2013.

3. Andreeva, L.E., V.Z. Tarantula. Animale transgenice: aspecte fundamentale și aplicate / L.E. Andreeva, V.Z. Tarantula // Probleme și perspective ale geneticii moleculare. Volumul 1 / Rep. ed. E.D. Sverdlov. – M.: Nauka, 2003. – P. 184 – 217.

4. Clonarea umană. Probleme etice. – Paris, Editura UNESCO, 2004. – 21 p.

Tema nr. 4. Metode moderne de cercetare a genomului

Rezumat:

1. Abordare clasică a descifrarii secvențelor de ADN

2. Principiul pirosecventierii ADN-ului de mare randament

3. Realizări și perspective de secvențiere

4. Utilizarea metodelor bioinformatice în secvențiere

5. Istoria citirii genomului uman

Este imposibil să ne imaginăm biologia modernă (nu doar biologie moleculară și biochimie, ci și sistematică, teoria evoluției, antropologie, medicină) fără megaocteți de secvențe ADN citite, această carne și sânge. bioinformatica, domeniul cel mai dinamic în dezvoltare al științei biologice. Succesul în acest domeniu a fost obținut la sfârșitul secolului al XX-lea. datorită unei descoperiri în crearea de dispozitive tehnice și tehnologii pentru descifrarea genomilor. Determinarea secvențelor de nucleotide dintr-o moleculă de ADN se numește secvențiere (din engleză secvență - secvență), iar dispozitivele destinate acestui scop sunt numite secvențiere .

1. Abordare clasică a descifrarii secvențelor de ADN

Cea mai comună metodă de secvențiere a ADN-ului astăzi este „ metoda de terminare a lanțului", sau " metoda dideoxi", dezvoltată în anii '70. secolul trecut de Frederick Sanger (laureat de două ori al Premiului Nobel pentru chimie: pentru determinarea secvenței de aminoacizi a insulinei (1955) și pentru dezvoltarea unei metode de secvențiere a ADN-ului (1980)). Ieftinitatea, acuratețea și simplitatea comparativă a automatizării fac această metodă unică. Standarde de aur» dintre toate metodele existente pentru determinarea secvenței resturilor de nucleotide ale ADN-ului. Așa a fost descifrat întregul genom uman și metoda lui Sanger este încă de rutină în practica zilnică de laborator.

sunt amplificate

În primul rând, fragmentele de ADN a căror secvență urmează să fie determinată sunt copiate de mai multe ori ( sunt amplificate), apoi tăiate în bucăți scurte, care servesc ca șablon pentru sinteza catenelor complementare de ADN. Sinteza amintește în mare măsură de procesul de copiere a ADN-ului într-o celulă vie.

Particularitatea metodei este utilizarea de soiuri modificate chimic de patru dezoxiribonucleotide, componente ale lanțurilor ADN. Fiecare varietate este „marcată” cu o moleculă marker fluorescent sau „vopsea” în jargon. O bucată scurtă de ADN numită primer sau grund, inițiază sinteza ADN-ului la un anumit punct al lanțului șablon ADN. O enzimă specială sintetizează lanțul complementar - ADN polimeraza. În acest caz, soiurile de nucleotide marcate fluorescent, care sunt prezente în amestecul de reacție în cantități mult mai mici decât nucleotidele obișnuite, termină sinteza atunci când una dintre ele ajunge la capătul lanțului de ADN în creștere. (Ideea este că nucleotidele modificate nu au aceeași grupă chimică la care trebuie atașată următoarea nucleotidă pentru a continua lanțul.) Rezultatul este un amestec care conține setul complet de noi sintetizate. fragmente ADN, fiecare începând din același loc, dar terminând în toate pozițiile posibile de-a lungul catenei șablon de ADN.

Modern automatizat secvențiere separați aceste fragmente prin trecerea întregului amestec prin capilare subțiri umplute cu gel. Cu cât fragmentul este mai scurt, cu atât se mișcă mai repede în gel de-a lungul capilarului sub influența unui câmp electric. (Fragmentele de ADN sunt în esență ioni care se mișcă într-un câmp electric de la minus la plus.) Un proces numit electroforeza capilara, este atât de eficient încât fragmentul care tocmai a părăsit capilarul se dovedește a fi cu exact o nucleotidă mai lung decât cel care l-a precedat. Pe măsură ce fragmentul iese, acesta este iluminat de un laser, ceea ce face ca nucleotida marcată de la capătul său să strălucească. Calculatorul determină varietatea acestor nucleotide după culoarea blițului și înregistrează secvența aspectului lor, adăugând „litere” (nucleotide) în „text” (secvență ADN). În cazul descifrării unui întreg genom, sunt generate în acest fel miliarde de „texte” scurte, care sunt introduse într-un program special rulat pe supercomputere. Programul găsește locuri în care „textele” se suprapun și, aranjandu-le în ordinea corectă, construiește secvența completă a genomului.

Cele mai multe dezvoltări tehnologice noi sunt vizate miniaturizare, multiplexarea(în acest caz, conectarea în paralel a unităților cu performanță scăzută ale sistemului pentru a crește performanța generală) și automatizare proces de secvențiere. Toate pot fi împărțite în două clase. Primul combină metode de „secvențiere prin sinteză” în care bazele sunt determinate pe măsură ce sunt încorporate într-o catenă de ADN în creștere.

Co. al doilea clasa include tehnologii pentru decodarea secvențelor de bază singur molecule de ADN. Unele dintre ele sunt destul de exotice - cum ar fi citirea reziduurilor de nucleotide ADN în mod electronic sau optic pe măsură ce molecula „se strecoară” prin nanopor. O listă lungă de îmbunătățiri aduse sistemului de electroforeză capilară, cuplată cu creșterea automatizării și a îmbunătățirilor software, a redus costul secvențierii cu un factor de 13 de când secvențierele automate au apărut pentru prima dată în anii 1990.

Dar toate acestea par oarecum palide pe fundalul capacităților unei noi metode de secvențiere prin sinteză - o versiune sofisticată a pirosecvenței, fiind dezvoltată și implementată de 454 Life Sciences.

2. Principiul pirosecventierii ADN-ului de mare randament

Tehnologia dezvoltată de 454 Life Sciences se numește secvențierea pirofosfatului sau pirosecvențiere . Ideea de pirosecvențiere în sine, trebuie spus, nu este nouă: a apărut la începutul anilor 90 ai secolului trecut, dar metoda publicată atunci nu a reușit să înlocuiască metoda tradițională dideoxi Sanger. Cu toate acestea, dezvoltatorii de la 454 Life Sciences l-au completat cu capacitățile nanotehnologiei moderne, iar cantitatea s-a transformat în calitate. Prin urmare, ar fi mai corect să se numească metoda „pirosecvențierea ADN-ului în reactoare cu picoliter compacte”.

Viteză este unul dintre principalele avantaje ale noii metode de secvențiere. Numele metodei este împrumutat de la Chevrolet Chevelle SS 454 din 1970, renumit în Occident, cu un motor de 360 ​​de cai putere.

Întregul genom, toate moleculele sale de ADN, sunt fragmentate aleatoriu în bucăți de 300-500 de perechi de baze. Apoi lanțurile complementare ale fragmentului sunt separate și aceeași oligonucleotidă pentru toate este atașată la fiecare lanț de fragmente. adaptor„, ceea ce permite lanțurilor individuale să se lipească de plastic margele. (Secvența acestei oligonucleotide face posibilă recunoașterea șablonului ADN mai târziu în procesul de secvențiere.) În acest caz, amestecul de fragmente separate în lanțuri complementare este diluat în așa fel încât fiecare granulă să primească doar un lanț individual (!) .

Fiecare mărgele este închisă într-o picătură, înconjurată de ulei și care conține un amestec pentru realizarea unei reacții în lanț a polimerazei (PCR), care are loc separat în fiecare picătură de emulsie (așa-numita PCR în emulsie , ePCR). Acest lucru duce la „amplificarea clonală” a lanțurilor de ADN și, în rusă, la faptul că nu una, ci aproximativ 10 milioane de copii („clone”) ale unei matrice ADN unice sunt reținute pe suprafața mărgelei.

Apoi, emulsia este distrusă, din nou fragmentele de ADN dublu catenar (formate în timpul PCR) sunt separate și margele care poartă copii monocatenar ale șablonului ADN sunt plasate în godeuri " diapozitiv» - un slide cu un design special. Fiecare godeu dintr-un astfel de tobogan formează un separat picolitru"reactor" , în care va avea loc reacția de secvențiere.

Slide-ul reprezintă taiere bloc, obtinut prin mai multe cicluri de tragere si fuziune a fibrelor optice. Ca rezultat al fiecărui ciclu, diametrul fibrelor individuale scade pe măsură ce fibrele formează mănunchiuri de împachetare hexagonale cu diametru transversal crescător. Fiecare fibra are un miez cu un diametru de 44 microni, inconjurat de un strat de placare de 2-3 microni. Miezurile sunt apoi gravate, rezultând găuri≈55 µm adâncime, cu o distanță de ≈50 µm între centrele sondelor adiacente. Volumul unor astfel de „reactoare” este de 75 picolitri; densitatea de plasare pe suprafața de diapozitiv este de 480 de găuri pe milimetru pătrat. Fiecare diapozitiv poartă aproximativ 1,6 milioane de godeuri, fiecare dintre ele conținând câte o perlă (!) cu un șablon ADN. Glisa este plasată în camera de curgere în așa fel încât a canal 300 microni inaltime, prin care reactivii necesari patrund in godeuri.

Reactivii livrați în camera de curgere curg într-un strat perpendicular pe axa godeurilor. Această configurație permite ca reacțiile să fie efectuate simultan pe perle care poartă șabloane ADN în godeuri separate. Adăugarea și îndepărtarea reactanților și a produselor de reacție are loc prin transport prin convecție și difuzie. Timpul de difuzie între flux și puțuri este de aproximativ 10 secunde și depinde de înălțimea camerei de curgere și de adâncimea puțurilor. Adâncime găurile sunt calculate cu atenție pe baza următoarelor considerații:

1. Godeurile trebuie să fie suficient de adânci, astfel încât bilele care poartă șablonul ADN să nu sară din ele sub influența convecției.

2. Ele trebuie să fie suficient de adânci pentru a preveni difuzia produselor de reacție din godeurile în care a avut loc încorporarea nucleotidelor în godeurile în care încorporarea nu a avut loc.

3. Godeurile trebuie să fie cât de mici este necesar pentru a permite difuzarea rapidă a nucleotidelor în godeu și spălarea rapidă a nucleotidelor rămase și a produselor de reacție la sfârșitul fiecărui ciclu, ceea ce, la rândul său, este necesar pentru a asigura o productivitate ridicată de secvențiere și pentru a reduce costurile cu reactivi. .

Pe lângă margelele cu matricea ADN, mărgele chiar mai mici sunt „turnate” în fiecare godeu - fiecare cu „șezând” pe suprafața sa ( imobilizat)enzime, necesar pentru secvențierea pirofosfatului. Nucleotidele (un tip la un moment dat) și alți reactivi necesari pentru reacția de secvențiere sunt introduse secvenţial într-o cameră de curgere unde este plasată lama.

De fiecare dată când o anumită nucleotidă este introdusă în lanțul de ADN în creștere într-una dintre găuri, o moleculă este eliberată în ea pirofosfat , care la rândul său este un precursor necesar al unei componente a unei alte reacții enzimatice. Este catalizat de o enzimă specială luciferaza Licurici Photinus pyralis. Dar pentru implementarea sa, este necesar adenozin trifosfat (ATP). Pirofosfatul nou format este transformat în ATP în godeu sub acțiunea unei alte enzime - ATP sulfurilază . Și apoi luciferaza se oxidează luciferină la oxiluciferină, iar această reacție este însoțită chemiluminiscenţă - într-un mod simplu, cu un mic fulger de lumină. Partea inferioară a glisierei este în contact optic cu un ghid de lumină cu fibră optică conectat la dispozitiv cuplat cu încărcare(senzor CCD, dispozitiv cuplat cu încărcare). Acest lucru face posibilă înregistrarea fotonilor emiși din fundul fiecărui godeu individual în care a fost introdusă o nucleotidă cunoscută. Schema generală de pirosecvențiere este prezentată în Fig. 1.

Prin asocierea exploziilor înregistrate din fiecare godeu cu tipul de nucleotidă prezent în camera de curgere la un moment dat, computerul urmărește în mod constant creșterea catenelor de ADN în sute de mii de godeuri simultan. Timpul necesar pentru ca reacția enzimatică să apară pentru a produce un „fulger” detectabil este de ordinul 0,02-1,5 secunde. Astfel, viteza de reacție este determinată de viteza de transfer de masă, care lasă loc de îmbunătățire prin accelerarea livrării de reactivi. După ce fiecare nucleotidă intră în camera de curgere, este spălată cu o soluție care conține enzima apiraza . Astfel, înainte ca următoarea nucleotidă să fie „lansată” în cameră, orice nucleotide rămase acolo din runda anterioară sunt îndepărtate din toate godeurile.

Includerea unei anumite nucleotide este detectată ca urmare a eliberării de pirofosfat anorganic și a emisiei ulterioare de lumină. Identificați godeurile care conțin margele cu matrice Lanțul ADN poate fi realizat prin citirea „secvenței cheie” a oligonucleotidei adaptoare cusute la începutul fiecărui șablon ADN. Nivelul de fundal este scăzut din semnalul înregistrat, apoi semnalul este normalizat și corectat.

Intensitate semnalul normalizat pentru fiecare godeu specific în timpul intrării unei anumite nucleotide în camera de curgere este proporțional număr nucleotide încorporate. Liniaritatea dependenței este păstrată pentru homopolimeri lungime de cel puțin opt nucleotide. Cu această secvențiere de sinteză, se pierde un număr foarte mic de șabloane ADN de pe fiecare mărgele. sincronism, adică ajung înainte sau încep să rămână în urma altor matrice. Corectarea unor astfel de schimbări este necesară, deoarece se creează pierderea sincronismului cumulativ Efect, ceea ce reduce foarte mult calitatea citirii pe măsură ce lungimea acesteia crește. Ținând cont de acest lucru, angajații companiei 454 au dezvoltat un algoritm special care vă permite să evaluați și modifica la „zbor” și completarea incompletă a lanțului, care are loc în găuri individuale. Precizia ridicată a decodării secvenței este obținută prin faptul că sistemul efectuează numeroase lecturi a aceluiași fragment, ceea ce face posibilă construirea unui singur generalizat (așa-numitul consens) ulterior.

Citirile individuale ( citeste - din engleza citit, citit) din aceeași secțiune de ADN sunt aliniate unul față de celălalt pe baza intensității semnalelor în momentul în care o anumită nucleotidă curge prin cameră și nu pe baza secvenței acestor citiri. Apoi se face media semnalelor corespunzătoare și numai apoi se înregistrează secvența rezultată. Această abordare îmbunătățește semnificativ calitatea decodării secvenței și oferă posibilitatea de a evalua calitatea acesteia.

În 2005, oamenii de știință de la 454 Life Sciences, folosind tehnologia lor, au reușit să descifreze genomul bacterian format din 600 de mii de nucleotide. Mycoplasma genitalium cu o precizie de 99,4%, precum și un genom format din 2,1 milioane de nucleotide Streptococcus pneumoniae.

Poza 1 - Schema de pirosecvențiere. A - ADN-ul este fragmentat, la fragmente sunt cusute oligonucleotide-„adaptori”; moleculele de ADN dublu catenar rezultate sunt separate în două catene complementare. B - Moleculele de ADN monocatenar sunt atașate de margele în condiții care încurajează doar o moleculă să aterizeze pe mărgele. Granulele individuale sunt conținute în picături de amestec de reacție, înconjurate de ulei. Numărul de molecule de pe o sferă este crescut de milioane de ori prin reacția în lanț a polimerazei în emulsie (ePCR). ÎN - Emulsia se rupe, iar lanțurile de fragmente de ADN formate în urma ePCR sunt separate. Perlele, purtând pe suprafața lor milioane de copii monocatenar ale fragmentului original de ADN, sunt plasate în godeurile unei lame de fibră optică, câte una în fiecare godeu. G - La fiecare godeu se adauga margele mai mici, purtand pe suprafata lor enzimele necesare pirosecventierii. D - Micrografie a emulsiei care arată picăturile „goale” și picăturile care conțin mărgele cu șablon de ADN. Săgeata groasă indică o picătură de 100 μm, săgeata subțire indică o perlă de 28 μm. E - Microfotografie a unui fragment dintr-o lamă cu fibră optică obţinută cu ajutorul unui microscop electronic cu scanare. Sunt vizibile placarea cu fibră optică și puțurile goale

Lucrarea, care a introdus și a testat pentru prima dată noua metodă, raportează că întregul genom Mycoplasma genitalium a fost citit dintr-o singura miscare! În primul rând, întregul genom a fost fragmentat și transformat într-o bibliotecă de bucăți de ADN, așa cum este descris mai sus (munca unei persoane timp de 4 ore). După efectuarea PCR în emulsie și plasarea granulelor rezultate cu șabloane ADN pe o lamă de 60 mm 2 (care a durat un angajat 6 ore), procesul s-a încheiat cu o funcționare automată a instrumentului de 4 ore, constând din 42 de cicluri.

Ca urmare a ansamblării secvențelor citite (fiecare aproximativ 108 perechi de baze), s-au obținut 25 de fragmente continue separate, așa-numitele contigs (din engleza contigious - touching), cu o lungime medie de 22,4 mii de perechi de baze. Aceste fragmente au acoperit aproximativ 96,54% din întregul genom al micoplasmei. Din restul de 4,6% din genom necitit, 3% au fost nerezolvate reluări. Astfel, 99,5% din secvența unică a genomului a fost secvențiată dintr-o singură mișcare.

3. Realizări și perspective de secvențiere

Deși prima versiune a instrumentului de la 454 Life Sciences a putut înlocui cu ușurință peste 50 de secvențiere capilare Applied Biosystem 3730XL la o șesime din preț, răspunsul comunității științifice a fost surprinzător de călduț. În loc să accepte noua tehnologie și să înceapă să-și folosească potențialul inepuizabil, mulți oameni de știință obișnuiți să folosească metoda Sanger au început să vorbească despre probleme precum acuratețea transcripției, durata citirilor individuale, costul infrastructurii... Și unii pur și simplu s-au răzvrătit împotriva trebuie să lucreze cu cantități mari de informații produse folosind noua tehnologie.

Ceea ce majoritatea criticilor nu au observat, totuși, a fost că multe dintre obstacolele în calea secvențierii de generație următoare au afectat și eforturile timpurii ale lui Sanger. Apoi lungimea citirii avea doar 25 de perechi de baze și a ajuns la 80 numai după apariția dideoxinucleotidelor terminale ale lui Fred Sanger. Tehnologia „secvențiere prin sinteză”, bazată pe izolarea pirofosfatului, a făcut inițial posibilă citirea segmentelor de maximum 100 de nucleotide. După 16 luni pe piața biotehnologiei, aceasta a fost îmbunătățită la 250 de perechi de baze. Evoluțiile recente fac posibilă citirea a aproximativ 500 de perechi de baze, aducând noua metodă mai aproape de metoda Sanger cu ≈1000 de nucleotide ale sale.

Un alt factor important, pe lângă lungimea citirilor individuale, este numărul de citiri , produs ca urmare a unui " alerga» secvențiator, normalizat la costul unei astfel de „rulari”. Această problemă este bine abordată de 454 de concurenți din Life Sciences, ale căror sisteme produc de zece ori mai multe citiri cu prețul scurtării acestora la doar 35 de nucleotide (sau mai puțin). Există trei sisteme comerciale de secvențiere ADN de ultimă generație pe piață astăzi:

Roche (454) GS FLX Genome Analyzer, distribuit de Roche Applied Sciences. (454 Life Sciences a fost achiziționat de gigantul Roche Diagnostics în martie 2007 pentru 154,9 milioane USD, dar continuă să rămână o divizie independentă);

Sequencer Illumina Solexa 1G și

Cel mai recent sistem SOLiD de la Applied Biosystems.

Alte sisteme de decodare ADN care au apărut deja pe piață includ „ a treia generatie „și se bazează pe analiză singur molecule. Au fost dezvoltate de VisiGen și Helicos.

Și în timp ce citirea unui genom bacterian la un moment dat a fost o realizare impresionantă, inițial nu era clar care biologic sarcini problemele care sunt inaccesibile bunei vechi metode Sanger pot fi rezolvate prin adoptarea noii metode de pirosecvențiere. Într-adevăr, primele proiecte care au implicat instrumentul Roche 454 GS20 au constat doar în „recitirea” genomurilor bacteriene deja descifrate și în susținerea datelor suplimentare din „proiectele Sanger” mari, deja în desfășurare. În același timp, cercetări în domeniu metagenomica , pe lângă lucrul cu cantități uriașe de date, uneori mai mari decât genomul uman, a suferit de distorsiuni introduse în etapele de construire a bibliotecilor și de clonare a fragmentelor pentru secvențiere.

În acest sens, tehnologia 454, care combină ePCR și pirosecvențierea, are un avantaj incontestabil față de metoda Sanger. Emulsion PCR permite amplificarea fara nicio preferinta molecule de ADN unice, înglobându-le într-o picătură de emulsie și eliminând competiția de la alte șabloane ADN pentru un număr limitat de ADN polimeraze. Pyrosequencing, la rândul său, realizează o citire paralelă a acestor șabloane cu un semnal de ieșire luminoasă care poate fi citit de un computer. Primele astfel de studii, publicate în 2006, au arătat flexibilitatea extraordinară a metodei de nouă generație folosită pentru a studia diversitatea microbiană a ecosistemelor miniere subterane de adâncime, a ecosistemelor de adâncime și a „comunităților” virale marine („comunități”). virome") în mai multe oceane.

Un studiu interesant care combină metagenomic analiză și " Paleontologia ADN" a fost efectuată la sfârșitul anului 2005. O singură rulare a instrumentului Roche (454) GS20 a fost suficientă pentru a analiza 13 Mb din secvența genomului veche de 28.000 de ani. mamut. Această muncă a deschis calea pentru proiectul de secvențiere a genomului, mai dificil din punct de vedere tehnic. Neanderthal. Dificultatea unui astfel de proiect este că cantitatea de ADN antic de Neanderthal izolată din probele osoase reprezintă doar 5% din cantitatea obținută din „material proaspăt”. În consecință, secvențierea durează de 20 de ori mai mult decât este necesar pentru genomul uman modern. În plus, contribuția degradării ADN-ului în probele conservate la temperaturi moderate, combinată cu erorile inerente noii metode de pirosecvențiere, depășește adesea nivelul de diferență găsit pentru genomul uman de Neanderthal și cel modern. Prin urmare, pentru a afirma că secvența rezultată este cu adevărat veche și nu prins accidentalîn drog ADN-ul modern este mult mai ușor în cazul mamutului - elefanții moderni, spre deosebire de oameni, nu se găsesc des în laboratoare. Pentru a obține adevărata secvență a unui genom antic de mamifer, este necesar să multe runde de lectură fiecare regiune a genomului și, de asemenea, verifică originea regiunilor citite.

Împreună cu o descoperire în secvențiere amestecuri complexe DNA, astfel de proiecte vor face posibilă studierea orice ecosistem pe planetă la nivelul secvenţelor de ADN. Acest lucru va oferi acces la florăȘi faună Acum 100 de mii de ani - posibilități care depășesc cele mai sălbatice așteptări ale trecutului foarte recent.

La nivel celular, secvențierea de generație următoare (în continuare vorbim nu numai despre pirosecvențiere, ci și despre alții noi metode de secvențiere prin sinteză) le permite oamenilor de știință să identifice pentru prima dată mutații în orice organism pentru întregul genom. Așa s-au găsit alelele responsabile de rezistența la antibiotice Mycobacterium tuberculosis, și, de asemenea, a identificat toate mutațiile din genomul a 9 milioane de perechi de baze într-o tulpină de bacterii care a evoluat de peste 1000 de generații. Aceste eforturi timpurii nu numai că au demonstrat capacitatea noii tehnologii de a detecta mutații și erori în lucrările științifice publicate, ci și dificultățile asociate cu utilizarea acesteia, cum ar fi erorile de citire. homopolimer secvențe în timpul pirosecvenței (454) sau scăderea rapidă a calității citirii mai aproape La 3' capăt secvențe în sisteme cu lungimi de citire individuale scurte (Solexa sau SOLiD de la Applied Biosystem).

Anterior, pentru a depăși aceste dificultăți, datele obținute prin pirosecvențiere au fost completate cu informații obținute prin metoda clasică Sanger. Dar, deoarece costurile și cheltuielile necesare pentru partea Sanger a experimentului rămân prohibitiv de mari, multe laboratoare se bazează astăzi doar pe metode de generație mai nouă, combinând de obicei citirile de pirosecvențiere relativ lungi cu citirile scurte, dar ieftine (și, prin urmare, numeroase) produse de Solexa. și sisteme SOLiD . Acest combinaţie diverse platforme permit evaluarea independentă a calității muncii lor, precum și verificarea secvențelor de referință stocate în bazele de date publice.

Obținerea unui număr mare de secvențe ADN din diferite organisme strâns înrudite conduce la progres și dezvoltă o abordare numită resecvențierea (resecvențiere), în care secvențele sunt tratate diferit față de asamblarea unui genom proaspăt secvențial. La resecvențiere, ansamblul este trimis celui aflat deja la îndemână referinţă secvență și, prin urmare, necesită o acoperire semnificativ mai mică (de 8-12 ori) decât în ​​cazul ansamblului genomului de novo(de 25-70 de ori). Această abordare a fost aplicată în munca de descifrare a 10 genomi mitocondriali de mamifere, ceea ce a făcut posibilă studierea geneticii populației pe baza nu pe secvențe scurte, ci pe genomuri mitocondriale complete. În prezent, numeroase proiecte de descifrare a genomilor microbieni sunt în desfășurare nu numai pentru a extinde lista de genomi disponibili, ci și pentru a efectua viitoare studii comparative care să compare genotipul și fenotipul unui organism la nivel genomic.

Lucrările asupra organismelor care nu fac parte din planurile de secvențiere genomică poate merge departe, datorită capacității noilor metode de secvențiere de a descifra direct secvențele transcrieri (mai precis, cADN - copii ADN ale ARN-ului mesager) în celulă. Studierea transcriptelor prin secvențiere directă are o serie de avantaje față de metoda de hibridizare pe micromatrice ADN. Cheia aici este că secvențierea nu necesită nicio cunoaștere a secvenței genomice a organismului a priori, deoarece secvența de transcriere poate fi comparată imediat cu o secvență de referință a unei specii strâns înrudite dintr-o bază de date folosind algoritmi bioinformatici standard. Cunoașterea secvențelor de transcriere poate schimba fundamental studiul organismelor ale căror genomuri nu sunt în prezent în coada pentru decodare și, în unele cazuri, nu vor fi niciodată acolo. Prima lucrare în acest domeniu a arătat că este posibil să se compare secvențele (ADNc și, respectiv, genomic) a două specii la fel de îndepărtate una de cealaltă ca și leguminoasele. Meticago truncatulași o plantă standard Arabidopsis thaliana. Au fost descoperite și multe transcrieri de porumb nedescrise anterior Zea mays.

Analiza directă a transcrierilor va ajuta la eludarea problemei cu care se confruntă organismele prohibitiv de mare genomurilor. În ciuda proiectelor de succes de descifrare a genomurilor virale, bacteriene și ale mamiferelor mari, metoda lui Sanger a lăsat sarcina de a descifra genomurile. poliploid plantele succesorilor lor. Acești genomi gigantici, aparținând adesea unor plante economice importante (de exemplu, genomul grâului are 16 miliarde de perechi de baze), au făcut toate încercările anterioare de a-l descifra în zadar. Cu toate acestea, perspectiva unei secvențieri ieftine exprimat secțiuni ale genomului (adică transcrieri) ne permite să sperăm la studiul cu succes al genomilor unor astfel de plante, cel puțin la nivel funcțional.

În cele din urmă, noile metode de secvențiere au aplicații practice în medicină. De exemplu, în genetica cancerului, alelele specifice cancerului pot fi urmărite în țesuturi prin secvențierea ADN-ului genomic de mare performanță în cazurile în care metoda Sanger eșuează. Și aici marele avantaj al noii metode este citirea repetată a secvenței.

Deși noile tehnici de secvențiere a ADN-ului au stimulat o mare parte de cercetări care nu ar fi fost posibile în trecutul recent, oamenii de știință și inginerii care au dezvoltat aceste tehnologii - precum și companiile care comercializează aceste tehnologii - au mult de făcut pentru a le îmbunătăți. În primul rând, reduce costul. O reducere a prețului cu unul sau două ordine de mărime este necesară pentru a realiza speranțe personal genomica , care își propune să resecvențieze genomurile individuale pentru mai puțin de 1.000 USD. In plus, reducerea ratei de eroare va fi de asemenea salutat cu căldură - nu numai pentru următoarea generație de metode, ci și pentru metoda Sanger, care va continua să aducă contribuții în viitorul apropiat. Poate că vor apărea artificial schimbat de specialitate ADN-polimerazele, furnizând informații despre secvența ADN sub forma unui semnal luminos emis. Pe măsură ce costul tehnologiei scade, cantitatea de informații acumulate va crește exponențial, ceea ce poate crea un blocaj în cercetare. Prin urmare, o parte din eforturile de dezvoltare a noilor tehnologii de secvențiere trebuie direcționate către dezvoltare bioinformatica.

Genomul uman

Decodificarea genomului uman este un eveniment la fel de important în istoria omenirii precum descoperirea electricității, inventarea radioului sau crearea computerelor.

Puțină istorie.ÎN 1988 Institutul Național de Sănătate din SUA a început un proiect "Genomul uman", condus de un laureat al Premiului Nobel James Watson. Scopul principal al proiectului este de a afla secvența bazelor nucleotidice din toate moleculele de ADN uman și de a stabili localizarea, i.e. cartografiază complet toate genele umane.

S-a planificat că se vor desfășura lucrări pentru a determina secvența de nucleotide a ADN-ului uman ( Secvențierea ADN-ului) trebuie sa se încheie în 2005. Cu toate acestea, după primul an de muncă, a devenit clar că viteza de secvențiere a ADN-ului este foarte scăzută și ar fi imposibil să finalizați munca într-un asemenea ritm. va dura aproximativ 100 de ani.

A devenit evident că era necesar căutarea de noi tehnologii secvențiere, crearea de noi tehnologii informatice și programe de calculator originale. Era imposibil într-un singur stat, și alte țări s-au alăturat programului.

Cercetarea coordonată la scară largă a început să fie efectuată sub auspiciile unei organizații internaționale ^ Organizația Genomului Uman (HUGO). Din 1989, Rusia s-a alăturat proiectului. Toți cromozomii umani au fost împărțiți între țările participante, iar Rusia i-a primit pentru cercetare Cromozomii 3, 13 și 19. Au fost implicați în proiect câteva mii de oameni de știință din 20 de țări.

În 1996, au fost create bănci de date ADN uman la nivel mondial. Orice secvență de nucleotide nou determinată mai mare de 1 mie de baze trebuia făcută publică prin Internet în 24 de ore de la descifrare, altfel articolele cu aceste date nu erau acceptate în reviste științifice. Orice specialist din lume ar putea folosi aceste informații.

Până la începutul lui 1998, doar aproximativ ^3% din genom. În acest moment, o companie privată americană din Maryland s-a implicat în mod neașteptat în lucrare. Celera Genomics sub conducerea Craig Venter, care a anunțat că își va finaliza activitatea cu 4 ani înaintea consorțiului internațional.

A început o cursă fără precedent în știință. Cele două echipe au lucrat independent, fără efort pentru a ajunge primele la linia de sosire. În timpul implementării Proiectului Genomul Uman, au fost dezvoltate multe metode noi de cercetare, dintre care majoritatea accelerează și reduc semnificativ costul decodării ADN-ului. Aceste metode de analiză sunt acum folosite în medicină, criminalistică etc.

În iunie 2000 an, două echipe concurente și-au combinat datele, anunțând oficial finalizarea lucrărilor lor. Si in februarie 2001 au apărut publicații științifice ale unei versiuni preliminare a structurii genomului uman. Calitatea secvențierii este destul de ridicată și presupune doar 1 eroare la 50 kb.

Genomul uman a intrat în istorie drept unul dintre cele mai costisitoare și mai costisitoare proiecte. În total, mai mult de ^ 6 miliarde de dolari.

Apare o întrebare firească: ce fel de genomul persoanei a fost determinat ca urmare a acestor eforturi titanice, cine este această persoană anume? Potrivit datelor disponibile, Celera s-a concentrat în principal pe genomul unei persoane, despre care se știe doar că era un bărbat alb, de vârstă mijlocie. Cel mai probabil, era șeful corporației, însuși Craig Venter. Consorțiul internațional a folosit materiale de la cel puțin șapte persoane diferite în activitatea sa.

Genomul uman este format din 24 de cromozomiȘi 3,2 miliarde bp Cromozomii umani au fost numerotate după mărime: cel mai mare este pe cromozomul 1, cel mai mic este pe cromozomul 22. De-a lungul timpului, s-a dovedit că cromozomul 22 conține mai mult ADN decât cromozomul 21, dar ordinea de numerotare nu a fost modificată pentru a nu crea confuzie. Există doi cromozomi sexuali separati: X și Y (în mod convențional, ele pot fi numite volumele nr. 23 și nr. 24 din Enciclopedia genomului uman).

^ În genomul feminin conținea doar 23 de cromozomi din 24, iar toate acestea sunt reprezentate în celule somatice în două copii. La bărbați, celulele conțin Enciclopedia umană completă, toți cei 24 de cromozomi, dar doi dintre ei (cromozomii X și Y) există în copii unice.

Diferiții cromozomi sunt foarte diferiți unul de celălalt prin numărul și proprietățile genelor(primul, cel mai mare, cromozomul conține 263 milioane bp, constituind 2237 gene, iar cromozomul 21 conține 50 milioane bp și 82 gene). www. ansamblu. org

Cromozomii diferă și prin importanța informațiilor înregistrate în ei. Numărul de gene asociate cu diferite boli majoritatea pe cromozomul X – 208; la 1 hms – 157; și în 11 hms - 135. Cele mai puține astfel de gene sunt în Y hms - doar 3. Cu toate acestea, numai totalitatea tuturor cromozomilor oferă celulelor informații complete care permit unei persoane să se dezvolte și să trăiască normal. În absența oricărei perechi de cromozomi, viața unui anumit individ devine imposibilă.

Dacă este pierdut din orice motiv doar unul din pereche starea cromozomală a unei persoane este foarte diferită de norma. De exemplu, monosomie parțială al 5-lea cromozom conduce la sindromul pisicii plânse. Copiii cu această anomalie au un plâns neobișnuit, care este cauzat de modificări ale laringelui, precum și ale craniului și ale feței.

În celulele umane ADN-ul este de asemenea disponibil, situat nu în cromozomi, ci în mitocondrii. Aceasta este, de asemenea, o parte din genomul uman, numit cromozomul M. Spre deosebire de genomul nuclear, genele mitocondriale sunt aranjate compact, ca în genomul bacterian, și au propriul cod genetic (un fel de „jargon genetic”). MitDNA este responsabil pentru sinteza doar a câtorva proteine ​​în celulă. Dar aceste proteine ​​sunt foarte importante pentru celulă, deoarece sunt implicate în furnizarea energiei celulei.

Se crede că mitocondriile au apărut în celulele eucariote ca urmare a simbiozei organismelor superioare cu bacteriile aerobe.

MitDNA se transmite din generație în generație numai prin linia feminină. În timpul fecundației, un spermatozoid cu un set de cromozomi paterni, dar fără mitocondrii paterne, intră în ovul. Doar oul oferă mitADN-ului său embrionului. Prin urmare, mitDNA este convenabil de utilizat pentru a determina gradul de relație atât în ​​cadrul speciilor, cât şi între diferiţi taxoni.

Unul dintre scopurile cercetării genomului uman a fost acela de a construi o hartă precisă și detaliată a tuturor cromozomilor. Harta genetica este o diagramă care descrie ordinea în care genele și alte elemente genetice sunt localizate pe un cromozom. ( snips-repetă-gene).

ÎN codificare nu mai sunt implicate proteine 1,5 % ADN cromozomial uman ( acestea. Instrucțiunile genetice pentru formarea unui individ uman ocupă doar 3 cm dintr-o moleculă de ADN uman de doi metri).

Analiza genomului uman a arătat că are aproximativ ^ 40 de mii. gene (pentru azi). Cele mai scurte gene conțin numai 20 bp (genele endorfinelor provocând un sentiment de plăcere). Cea mai lungă genă care codifică una dintre proteinele musculare(miodistrofină), conţine aproximativ 2,5 milioane bp

^ Densitate genele de pe cromozomi variază foarte mult. Densitatea medie este de aprox. 10 gene la 1 milion bp. Cu toate acestea, în cromozom 19 densitatea este 20 de gene, iar în cromozomul Y - total 1,5 gene per milion Dacă comparăm densitatea genelor cu densitatea populației oamenilor, cromozomul Y seamănă cu Siberia noastră, iar cromozomul 19 seamănă cu partea europeană a Rusiei. Densitatea genelor scade odată cu complexitatea evolutivă a organismelor. Pentru comparație, genomul bacterian conține peste 1000 gene la 1,0 milion i. n., în drojdie cca 450 gene cu 1,0 milioane bp, iar în viermele C. elegans - aproximativ 200 .

Așa cum oamenii au familii, genele sunt unite în familii prin asemănarea lor. Există aproximativ 1,5 mii de astfel de familii în genomul uman. Și numai despre sute dintre ei specific pentru oameni și vertebrate. Cea mai mare parte a familiilor de gene se găsesc atât la oameni, cât și la râme.

Diferite gene ale aceleiași familii au apărut în timpul evoluției din o genă precursoare ca o consecinţă a mutaţiilor. Genele „înrudite” îndeplinesc cel mai adesea o funcție similară. De exemplu, genomul uman are aproximativ 1.000 de gene de receptori olfactiv.

Se găsește uneori în familiile de gene pseudogene. Acestea sunt gene care și-au pierdut capacitatea de a fi exprimate. Sunt precedate de litera greacă . Nu este în întregime clar de ce genomul are nevoie de astfel de gene, de ce le-a păstrat în evoluție și nu a scăpat de ele. Genomul uman conține aproximativ 20.000 de astfel de pseudogene. În special, în familia uriașă de gene olfactive, aproximativ 60% sunt pseudogene. Se crede că pierderea masivă a genelor funcționale a avut loc în ultimii 10 milioane de ani din cauza scăderii rolului mirosului la oameni în comparație cu alte mamifere.

Aproximativ 20% din genele umane funcționează în toate tipurile de celule umane. Genele rămase funcționează numai în anumite țesuturi și organe. De exemplu, globina genele sunt exprimate numai în celulele sanguine, deoarece funcția lor principală este de a transporta oxigen.

Un exemplu de cea mai înaltă specializare a genelor este genele olfactive. În fiecare celulă a organului olfactiv uman - bulbul olfactiv - funcționează doar 1 genă din 1000 posibile. Oamenii de știință au fost foarte perplexi de faptul că unele dintre aceste gene, pe lângă bulbul olfactiv, sunt activate într-un alt tip de celulă - spermatozoizi. Cum se leagă acest lucru cu percepția mirosului nu este încă pe deplin clar.

Hartizarea cromozomilor a făcut posibilă, de asemenea, identificarea localizării regiunilor responsabile pentru unele boli umane.

De exemplu, in primul genele cromozomiale asociate cu cancerul ductal mamar. În al doilea - cu obezitate. ÎN al treilea- cu schizofrenie. ÎN Al patrulea Pe cromozomul a fost descoperită o genă, ale cărei mutații duc la dezvoltarea alcoolismului. Mutații în regiunea terminală X-cromozomii provoacă predispoziţie la homosexualitate.

S-a atras atenția specialiștilor și asupra genelor asociate cu unele trăsături ale comportamentului uman. Aceste gene codifică proteine ​​implicate în transmiterea semnalelor între celulele nervoase (de exemplu, proteina serotonina). Oamenii de știință au numit gena care codifică receptorul serotoninei „gena sinuciderii”. Mutațiile acestei gene determină oamenii să aibă o tendință spre emoții negative și tendințe suicidare.

Un alt transmițător de semnal în sistemul nervos este dopamina- o substanta care joaca un rol cheie in functionarea centrilor placerii ai creierului. Excesul de dopamină provoacă hiperactivitate exploratorie la animale. S-a descoperit că una dintre genele care codifică proteinele receptorului de dopamină poate exista în diferite forme alelice (lungi și scurte). Oamenii cu alela lungă sunt mai înclinați să caute experiențe noi, motiv pentru care gena descoperită a fost numită „genom care caută noutăți”. La americani, alela lungă a genei receptorului de dopamină este de 25 de ori mai frecventă decât la, să zicem, asiaticii de sud și de est. Din istorie știm cum a fost așezată America de către europeni. În primul rând, erau oameni energici, predispuși la aventurism, curioși și impulsivi. Așa că au introdus alela lungă a „genei care caută noutăți” în populația americană modernă.

Recent, au fost descoperite două gene care sunt responsabile pentru instinctele materne (aceste gene au fost numite genele „instinctului matern”.). În același timp, spre surprinderea tuturor, s-a dovedit că fiicele primesc ambele gene de la tații lor. Animalelor cărora le lipseau genele „instinctului matern” nu le păsa de nou-născuți.

Trebuie subliniat faptul că, spre deosebire de genele responsabile de parametrii fizici, prezența genelor „bolnave” care modelează psihicul și comportamentul nu înseamnă că o persoană este complet condamnată la anumite manifestări negative. În primul rând, de regulă, nu una, ci un set de gene este responsabil pentru caracteristicile mentale. Există o interacțiune foarte complexă și uneori foarte ambiguă între ele, al cărei efect depinde de mulți factori diferiți. În al doilea rând, conform celor mai mulți oameni de știință, psihicul și comportamentul uman sunt doar unul la sută 50 sunt determinate de gene.

Una dintre metodele de studiu a influenței mediului asupra manifestării unui genotip este observarea gemenilor identici. Această abordare în genetică se numește „metoda gemenă”».

Gemenii identici sunt formați prin divizarea aceluiași zigot și conțin genomi identici. Deși apariția gemenilor este o apariție destul de rară (se crede că o persoană are un geamăn la fiecare 80-85 de nașteri), cu toate acestea, cazurile disponibile sunt suficiente pentru a efectua cercetări adecvate.

Una dintre cele mai clare moduri de a identifica o persoană este amprentele digitale. „Modelele” caracteristice se formează în embrion deja în a treia lună de dezvoltare și rămân neschimbate de-a lungul vieții. Când se compară „modelele” de piele ale gemenilor, s-a dezvăluit că acestea sunt foarte asemănătoare, dar, surprinzător, nu întotdeauna complet identice.

Când s-au studiat o serie de alte caracteristici, s-au observat și ușoare variații la gemeni: culoarea ochilor și a părului, forma urechii.

O comparație la scară largă a gemenilor identici unul cu celălalt a arătat că apariția unor astfel de gemeni boli infecțioase, precum rujeola, tusea convulsivă, varicela, depind aproape complet de agentul cauzal al bolii, dar poliomielita si tuberculoza sunt determinate și de proprietățile ereditare ale unei persoane. În special, incidența tuberculozei la ambii gemeni identici este de peste 3 ori mai mare decât la doi gemeni fraterni.

Un studiu pe gemeni realizat la Institutul Karolinska din Stockholm a arătat în mod convingător impactul semnificativ al factorilor de mediu (fumat, poluare, alimentație, stil de viață) asupra dezvoltării unor forme de boli maligne. În același timp, s-a remarcat influența factorilor genetici privind apariția cancerului cancer de prostată, colorectal și de sân.

Analizând gemeni, s-a constatat că dezvoltare mentală poate fi explicată și genetic. Dacă unul dintr-o pereche de gemeni identici este slab la minte, celălalt se dovedește aproape întotdeauna a fi același.

Oamenii de știință ruși au efectuat un studiu asupra copiilor gemeni cu vârsta cuprinsă între 7 și 12 luni pentru a determina măsura în care genetica și mediul influențează agresivitate, iritabilitate, activitate și sociabilitate. S-a dovedit că primele trei trăsături ale temperamentului sunt sub control genetic strict: agresivitatea comportamentului unui sugar: 94 la sută este determinată de genotipul său, activitate - 89 la sută, iritabilitate - 85 la sută. Iar sociabilitatea se formează aproape 90% sub influența mediului creat de părinți.

Datorită metodei de analiză dublă, cea mai discutată problema homosexualitatii. Există deja dovezi sigure că aproximativ 57% dintre gemenii și frații identici ai bărbaților homosexuali sunt, de asemenea, homosexuali. Pentru femeile lesbiene, cifra este de aproximativ 50%.

Conștientizarea homosexualității ca boală ereditară poate ajuta să decideți cum problema homofobiei(e rău să urăști oamenii bolnavi) și problema homosexualității agresive(acești oameni cer să fie recunoscuți ca sănătoși și cu drepturi depline, uneori chiar sunt mândri de particularitățile lor). Totuși, dacă considerăm homosexualitatea ca pe o boală, ca pe o patologie, situația se schimbă radical. Este greu de imaginat o persoană care stă mândră cu un semn: „Sufăr de schizofrenie, așa că cer respect pentru mine însumi ca membru cu drepturi depline al societății!”

Conform estimărilor moderne, speranța de viață uman, este asociat și cu factori genetici, al căror rol este estimat la 65-70%.

Numeroase și variate date sugerează că genomul ne determină în mare parte, dar și mediul interferează semnificativ cu esența noastră. Oamenii de știință compară uneori relația dintre gene și mediu cu un pistol și declanșator încărcat. Pistolul nu va trage până când nu este apăsat trăgaciul. Situația este aceeași într-o celulă, unde o genă servește ca un pistol încărcat și tot felul de factori de mediu îndeplinesc funcția de declanșare. Există o altă comparație - cu un joc de cărți: un jucător bun poate câștiga cu cărți proaste.

Pentru a înțelege numeroasele relații care există între manifestarea variantelor individuale de gene și influența diverșilor factori de mediu în acest proces, a fost creat un proiect internațional special - Proiectul genomului de mediu. Printre numeroasele obiective ale acestui proiect, principalul este, desigur, studiul influenței mediului asupra speranței de viață, precum și asupra apariției și dezvoltării diferitelor boli umane. În cele din urmă, acest proiect se poate dovedi nu mai puțin important și complex decât faimosul și foarte scump proiect de secvențiere a genomului uman. Și nu există nicio îndoială că va dura mult mai mult decât proiectul genomului.

Pe 25 aprilie, acum îndepărtat 1953, revista Nature a publicat o scrisoare mică de la tinerii și necunoscuții F. Crick și J. Watson către editorul revistei, care începea cu cuvintele: „Am dori să ne oferim gândurile despre structura sării ADN. Această structură are noi proprietăți care sunt de mare interes biologic.” Articolul conținea aproximativ 900 de cuvinte, dar – și nu este o exagerare – fiecare dintre ele își merita greutatea în aur.

„Tineretul răgușit” a îndrăznit să vorbească împotriva laureatului Nobel Linus Pauling, autorul celebrului helix alfa de proteine. Chiar cu o zi înainte, Pauling a publicat un articol conform căruia ADN-ul era o structură elicoidală cu trei catene, ca o împletitură a unei fete. Nimeni nu știa atunci că Pauling avea pur și simplu material insuficient purificat. Dar Pauling s-a dovedit a avea parțial dreptate - acum natura cu trei catene a unor părți ale genelor noastre este bine cunoscută. La un moment dat chiar au încercat să folosească această proprietate a ADN-ului în lupta împotriva cancerului, dezactivând anumite gene canceroase (oncogene) folosind oligonucleotide.

Biologia acidului nucleic a avut ghinion de mult timp. Este suficient să spunem că primul premiu Nobel pentru descoperirea structurii nucleotidelor a fost primit de germanul A. Kossel încă din 1910. Iar celebra reacție Feulgen pentru colorarea ADN-ului a fost propusă în ajunul primului război mondial și îmbunătățită în anii 1920. Atunci ar putea începe o nouă eră a biologiei, totuși...

Cu toate acestea, biologii erau încrezători că ADN-ul „monoton”, cu singurele sale patru baze diferite, pur și simplu nu poate transporta informațiile genetice pentru milioane de proteine ​​diverse. Și deși codul Morse cu trei elemente de codare fusese deja folosit, mentalitatea cercetătorilor nu ajunsese încă la nivelul erei informaționale cu sistemul său de înregistrare binară („0” și „1”) pentru orice informație.

Abia la începutul anilor 1950. Unii oameni de știință au început să acorde atenție ADN-ului, al cărui rol în transmiterea caracteristicilor ereditare la microorganisme a fost stabilit în 1943 de Oswald Avery. Rezultatele lui Avery au fost crezute de Salvador Luria, care, împreună cu Max Delbruck, a organizat un laborator lângă New York la o stație biologică din orașul Cold Spring Harbor.

Să notăm între paranteze că fizicianul M. Delbrück a fost elev al lui N.V. Timofeev-Resovsky în biologie și coautor al celebrului lor articol cu ​​K. Zimmer despre determinarea mărimii unei gene. Luria și Delbrück au studiat ciclul de viață al bacteriofagelor - viruși ai microorganismelor, în urma cărora au ajuns la presupuneri cu privire la rolul biologic al ADN-ului. Luria și-a trimis studentul absolvent James Watson la Laboratorul Cavendish din Cambridge, unde Maurice Wilkins și Rosalind Franklin au studiat structura ADN-ului folosind razele X (britanicii erau lideri în analiza biomoleculelor cu difracție de raze X).

Un fizician destul de tânăr, Francis Crick, a lucrat și el în laboratorul lui Wilkins, cunoscut în cercurile restrânse de laborator pentru scepticismul său științific: pentru el pur și simplu nu existau autorități, așa că și-a câștigat reputația de luptător. Articolul lui Pauling a fost adus în laborator de fiul său, care, apropo, i-a ajutat pe Watson și Crick să înțeleagă rolul compușilor complementari perechi ai bazelor azotate. Articolul a fost ultima picătură înainte de intuiția, sau înțelegerea... care a prins contur în descoperirea tinerilor oameni de știință.

Comunitatea științifică, însă, nu a recunoscut imediat descoperirea lor. Este suficient să spunem că Premiul Nobel pentru munca în domeniul ADN-ului a fost acordat pentru prima dată de „judecătorii” de la Stockholm în 1959 celebrilor biochimiști americani Severo Ochoa și Arthur Kornberg. Ochoa a fost primul (1955) care a sintetizat acid ribonucleic (ARN). Kornberg a primit premiul pentru sinteza ADN in vitro (1956).

În 1962 a fost rândul lui Crick, Watson și Wilkins. R. Franklin murise deja de cancer la vârsta de 37 de ani, altfel ar fi fost singura dată în istoria Premiilor Nobel când premiul ar fi fost acordat la patru, deși acest lucru nu este permis de cartă. Contribuția lui Franklin la dezvoltarea analizei de difracție de raze X a ADN-ului a fost pur și simplu neprețuită.

După descoperirea lui Watson și Crick, cea mai importantă problemă a fost identificarea corespondenței dintre structurile primare ale ADN-ului și proteinelor. Deoarece proteinele conțin 20 de aminoacizi și există doar 4 baze nucleice, sunt necesare cel puțin trei baze pentru a înregistra informații despre secvența de aminoacizi din polinucleotide. Pe baza unui astfel de raționament general, au fost propuse variante ale codurilor genetice „cu trei litere” de fizicianul G. Gamov și biologul A. Neyfakh. Cu toate acestea, ipotezele lor au fost pur speculative și nu au provocat prea mult răspuns în rândul oamenilor de știință.

Codul genetic din trei litere a fost descifrat de F. Crick până în 1964. Este puțin probabil să-și fi imaginat atunci că în viitorul previzibil va deveni posibil să se descifreze genomul uman. Această sarcină mi s-a părut de netrecut mult timp. Cu toate acestea, două descoperiri au făcut posibilă avansarea problemei.

În 1970, necunoscut comunității științifice generale, G. Temin și D. Baltimore au publicat articole în Nature despre transcriptază inversă (RT), o enzimă a virusurilor care conțin ARN, inclusiv cele canceroase, care sintetizează ADN pe un șablon de ARN, adică . efectuează o reacție opusă celei observate anterior în celule.

Descoperirea transcriptazei inverse a făcut posibilă izolarea primelor gene. Dar acest proces a fost extrem de intensiv în muncă și extrem de costisitor. Și 15 ani mai târziu, un anumit chimist din California le-a propus colegilor săi o reacție unică a polimerazei în lanț (PCR), care a devenit imediat faimoasă. În această reacție, enzima, polimeraza, „se plimbă ca o navetă” de-a lungul unui fragment de ADN, astfel încât PCR vă permite să produceți orice cantități din acest fragment necesare pentru analiză*.

PCR, precum și apariția celor mai noi tehnologii electronice și computere, au făcut ca sarcina de a descifra întregul genom uman să fie destul de realistă. Lunga dezbatere s-a încheiat la sfârșitul lunii septembrie 1988, când J. Watson a fost numit șef al proiectului HUGO - Organizația Genomului Uman.

Revista Time l-a numit pe Watson „vânător de gene” în acest sens. Omul de știință însuși a spus următoarele: „Aceasta este o perspectivă interesantă. În urmă cu treizeci de ani nici măcar nu puteam visa să cunoaștem structura genomului nici măcar a celui mai mic virus. Și astăzi am descifrat deja genomul virusului SIDA și am citit aproape complet genomul Escherichia coli cu un volum de 4,5 milioane de litere din codul genei. Cunoașterea exactă a structurii detaliate a genomului uman este uimitor!”

Și acum genomul a fost citit
Finalizarea lucrărilor de descifrare a genomului uman de către un consorțiu de oameni de știință a fost planificată pentru 2003, aniversarea a 50 de ani de la descoperirea structurii ADN-ului. Cu toate acestea, concurența și-a spus cuvântul și în acest domeniu.

Craig Venter a fondat o companie privată numită Selera, care vinde secvențe de gene pentru bani mari. Alăturându-se cursei de descifrare a genomului, ea a făcut într-un an ceea ce a avut nevoie de zece ani pentru a realiza unui consorțiu internațional de oameni de știință din diferite țări. Acest lucru a devenit posibil datorită unei noi metode de citire a secvențelor genetice și utilizării automatizării procesului de citire.

Deci, genomul a fost citit. S-ar părea că ar trebui să ne bucurăm, dar oamenii de știință au rămas perplexi: foarte puține gene s-au dovedit a fi la oameni - de aproximativ trei ori mai puțin decât se aștepta. Se credeau că avem aproximativ 100 de mii de gene, dar de fapt erau aproximativ 35 de mii, dar acesta nu este cel mai important lucru.

Nedumerirea oamenilor de știință este de înțeles: Drosophila are 13.601 de gene, viermii rotunzi de sol au 19 mii, muștarul are 25 de mii de gene. Un număr atât de mic de gene la oameni nu ne permite să-l distingem de regnul animal și să-l considerăm „coroana” creației.

Dar acolo unde sunt localizate genele, activitatea ADN-ului și a enzimelor care își sintetizează copiile sub formă de molecule de ARN mesager crește de 200-800 de ori! Acestea sunt „punctele fierbinți” ale genomului.

În genomul uman, oamenii de știință au numărat 223 de gene care sunt similare cu genele E. coli. E. coli a apărut cu aproximativ 3 miliarde de ani în urmă. De ce avem nevoie de asemenea gene „vechi”? Aparent, organismele moderne au moștenit de la strămoșii lor unele proprietăți structurale fundamentale ale celulelor și reacții biochimice care necesită proteine ​​adecvate.

Prin urmare, nu este surprinzător faptul că jumătate dintre proteinele de mamifere au secvențe de aminoacizi similare cu proteinele muștei Drosophila. La urma urmei, respirăm același aer și consumăm proteine ​​animale și vegetale, formate din aceiași aminoacizi.

Este uimitor că împărtășim 90% din genele noastre cu șoarecii și 99% cu cimpanzeii!

Genomul nostru conține multe secvențe pe care le-am moștenit de la retrovirusuri. Acești viruși, care includ virușii de cancer și SIDA, conțin ARN în loc de ADN ca material ereditar. O caracteristică a retrovirusurilor este, după cum sa menționat deja, prezența transcriptazei inverse. După sinteza ADN-ului din ARN-ul virusului, genomul viral este integrat în ADN-ul cromozomilor celulari.

Avem multe astfel de secvențe retrovirale. Din când în când „ipar” în sălbăticie, rezultând cancer (dar cancerul, în deplină conformitate cu legea lui Mendel, apare numai la homozigoții recesivi, adică în cel mult 25% din cazuri). Mai recent, s-a făcut o descoperire care ne permite să înțelegem nu numai mecanismul inserției virale, ci și scopul secvențelor de ADN necodante. S-a dovedit că este necesară o secvență specifică de 14 litere de cod genetic pentru a integra virusul. Astfel, se poate spera că în curând oamenii de știință vor învăța nu numai să blocheze retrovirusurile agresive, ci și să „introducă” intenționat genele necesare, iar terapia genică se va transforma dintr-un vis într-o realitate.

În corpul mamiferelor, retrovirusurile joacă un alt rol important. În ceea ce privește mamiferele, în care fătul se dezvoltă în interiorul corpului mamei, întrebarea este legitimă: de ce sistemul imunitar al mamei permite dezvoltarea unui organism care îi este pe jumătate străin genetic, deoarece jumătate din genomul fătului este patern?

Este vorba despre retrovirusuri care blochează activitatea limfocitelor T imune responsabile de respingerea organelor și țesuturilor care conțin proteine ​​străine, de exemplu, după transplantul de organe. Aceste retrovirusuri sunt activate în genomul celulelor placentei, care este format din țesutul fetal.

Recent, a fost descoperit un virus care blochează dezvoltarea (exprimarea) unui retrovirus. Dacă un șoarece însărcinat este infectat cu acest virus de blocare, puii se nasc normal și la timp. Dar dacă este introdus în celulele placentei, are loc un avort spontan al fătului, deoarece limfocitele T ale mamei sunt activate.

Nu uitați că secvențele retrovirale apar și direct la capetele cromozomilor - telomeri. După cum știți, telomerii constau din ADN monocatenar, care este sintetizat de enzima telomeraza folosind un șablon ARN. Se crede că telomerii sunt ceasul nostru molecular, deoarece se scurtează cu fiecare diviziune celulară. Anterior, se credea că nu există gene în telomeri, dar descifrarea genomului a arătat că există destul de multe gene acolo și sunt active în copilărie și la vârsta adultă, „disparând” treptat pe măsură ce corpul îmbătrânește.

Nici repetările tandem nu sunt atât de inactive. În mod normal, au un anumit număr de litere repetate trei, cinci și chiar șapte. Dar, în unele cazuri, ca urmare a mutațiilor, numărul de repetări începe să crească, ceea ce duce la instabilitatea genomului. Se ajunge chiar atât de departe încât să „rupă” capetele cromozomilor. Fragmentarea secțiunilor terminale ale unui cromozom poate duce la mișcări (translocarea) secțiunilor de ADN către un alt cromozom, precum și la sinteza unor astfel de forme de proteine ​​care provoacă moartea celulelor nervoase, așa cum se observă în coreea Huntington ereditară.

K. Venter a spus că înțelegerea genomului va dura sute de ani. La urma urmei, încă nu știm funcțiile și rolurile a peste 25 de mii de gene. Și nici nu știm cum să abordăm rezolvarea acestei probleme, deoarece majoritatea genelor sunt pur și simplu „tăcute” în genom, fără a se manifesta în niciun fel.

Trebuie luat în considerare faptul că genomul a acumulat multe pseudogene și gene „de schimbare”, care sunt, de asemenea, inactive. Se pare că secvențele necodificatoare acționează ca un izolator pentru genele active. În același timp, deși nu avem prea multe gene, ele asigură sinteza a până la 1 milion (!) dintr-o mare varietate de proteine. Cum se realizează acest lucru cu un set atât de limitat de gene?

După cum sa dovedit, există un mecanism special în genomul nostru - splicing alternativ. Constă în următoarele. Pe șablonul aceluiași ADN are loc sinteza diferitelor ARNm alternative. Splicing înseamnă „despărțire” atunci când se formează diferite molecule de ARN, care, parcă, „împart” gena în diferite variante. Aceasta are ca rezultat o diversitate inimaginabilă de proteine ​​cu un set limitat de gene.

Funcționarea genomului uman, ca și cea a tuturor mamiferelor, este reglată de diverși factori de transcripție - proteine ​​speciale. Aceste proteine ​​se leagă de partea reglatoare a genei (promotorul) și astfel îi reglează activitatea. Aceiași factori se pot manifesta diferit în țesuturi diferite. O persoană are propriii factori de transcripție, unici pentru el. Oamenii de știință nu au identificat încă aceste caracteristici pur umane ale genomului.

SNP
Există un alt mecanism al diversității genetice, care a fost dezvăluit doar în procesul de citire a genomului. Acesta este un polimorfism de nucleotide singular, sau așa-numiții factori SNP.

În genetică, polimorfismul este o situație în care genele pentru aceeași trăsătură există în variante diferite. Un exemplu de polimorfism, sau, cu alte cuvinte, alele multiple, sunt grupurile de sânge, atunci când un loc (regiune) cromozomial poate conține variante ale genelor A, B sau O.

Singularitatea în latină înseamnă singurătate, ceva unic. Un SNP este o schimbare în „litera” codului genetic fără „consecințe asupra sănătății”. Se crede că la om, SNP apare cu o frecvență de 0,1%, adică. Fiecare persoană diferă de ceilalți printr-o nucleotidă la fiecare mie de nucleotide. La cimpanzei, care sunt o specie mai în vârstă și, de asemenea, mult mai eterogenă, numărul de SNP-uri când se compară doi indivizi diferiți ajunge la 0,4%.

Dar dacă diferențele în SNP nu afectează sănătatea indivizilor, atunci de ce sunt ele interesante și importante? În primul rând, studiul SNP este de mare importanță teoretică. Ele ne permit să comparăm vârstele populațiilor și să le stabilim rutele de migrație. De exemplu, 22 de factori SNP au fost identificați în cromozomul sexual masculin (Y), a cărui analiză în 1007 europeni a făcut posibil să se determine că 80% dintre bărbații europeni au un „model SNP” similar, adică. "desen". Acest lucru sugerează că în urmă cu mii de generații, 4/5 dintre bărbații europeni aveau un strămoș comun!

Dar semnificația practică a SNP este de asemenea mare. Poate că nu toată lumea știe că astăzi cele mai comune medicamente sunt eficiente pentru nu mai mult de un sfert din populație. Diferențele genetice minime cauzate de SNP determină eficacitatea medicamentelor și tolerabilitatea acestora în fiecare caz specific. Astfel, 16 SNP-uri specifice au fost identificate la pacienții diabetici. În total, la analiza cromozomului 22, a fost determinată locația a 2730 de SNP. Într-una dintre genele care codifică sinteza receptorului de adrenalină au fost identificate 13 SNP, care pot fi combinate între ele, dând 8192 de variante diferite (haplotipuri).

Nu este încă pe deplin clar cât de rapid și complet vor începe să fie utilizate informațiile primite. Deocamdată, să dăm încă un exemplu concret.

În rândul astmaticilor, este destul de popular medicamentul albuterol, care interacționează cu acest receptor de adrenalină și suprimă un atac de sufocare. Cu toate acestea, din cauza diversității haplotipurilor oamenilor, medicamentul nu funcționează pe toată lumea, iar pentru unii pacienți este în general contraindicat. Acest lucru se datorează SNP: persoanele cu secvența de litere într-una dintre genele TCTC (T-timină, C-citozină) nu răspund la albuterol, dar dacă citozina terminală este înlocuită cu guanină (TCTCG), atunci există o reacție, dar parțială. Pentru persoanele cu timină în locul citozinei terminale din această regiune - TCTCT - medicamentul este toxic!

Proteomica
Această ramură complet nouă a biologiei, care studiază structura și funcția proteinelor și relațiile dintre ele, poartă numele genomicii, care se ocupă de genomul uman. Chiar nașterea proteomicii explică deja de ce a fost nevoie de programul Genom uman. Să explicăm cu un exemplu perspectivele pentru o nouă direcție.

În 1962, John Candrew și Max Perutz au fost invitați la Stockholm de la Cambridge împreună cu Watson și Crick. Aceștia au primit Premiul Nobel pentru Chimie pentru prima descifrare a structurii tridimensionale a proteinelor mioglobină și hemoglobină, responsabile de transportul oxigenului în mușchi și, respectiv, celule roșii din sânge.

Să ne amintim că chiar și la începutul anilor 1990. descifrarea structurii fiecărei proteine ​​noi a prezentat dificultăţi semnificative. Fiecare analiză a durat până la zece ani. Și, deși rezonanța magnetică nucleară (RMN) este acum utilizată în locul razelor X, este nevoie de mult timp și bani pentru a determina structura spațială a fiecărei proteine.

Proteomica face ca acest lucru să funcționeze mai rapid și mai ieftin. K. Venter a remarcat că a petrecut 10 ani izolând și secvenționând gena receptorului uman de adrenalină, dar acum laboratorul său petrece 15 secunde pe ea. Pe la mijlocul anilor '90. Găsirea „adresei” unei gene în cromozomi a durat 5 ani, la sfârșitul anilor 90 – șase luni, iar în 2001 – o săptămână! Apropo, informațiile despre SNP, dintre care există deja milioane astăzi, ajută la accelerarea determinării poziției genei.

Să revenim la proteomică. Cunoașterea secvențelor de aminoacizi și a structurii tridimensionale a anumitor proteine ​​a făcut posibilă dezvoltarea programelor de comparare a secvențelor genetice cu cele de aminoacizi și apoi a programelor pentru localizarea lor presupusă în structura tridimensională a polipeptidelor. Cunoașterea structurii tridimensionale vă permite să găsiți rapid variante chimice ale moleculelor în care, de exemplu, centrul activ este blocat sau să determinați poziția centrului activ într-o enzimă mutantă.

Se știe că o creștere a tensiunii arteriale este cauzată de enzima ACE, al cărei nume prescurtat este tradus din engleză ca enzimă de conversie a angiotensinei. Angiotensina, formată sub acțiunea enzimei, acționează asupra pereților arterei, ceea ce duce la hipertensiune arterială. Cu relativ mult timp în urmă, blocanții enzimelor ACE au fost descoperiți și au început să fie vânduți ca medicamente pentru hipertensiune arterială. Cu toate acestea, aceste medicamente s-au dovedit a fi ineficiente.

Analiza genomului a făcut posibilă izolarea genei ACE-2, care codifică o variantă mai comună și mai eficientă a enzimei. Apoi a fost determinată structura virtuală a produsului proteic, după care au fost selectate substanțele chimice care se leagă activ la proteina ACE-2. Așa a fost găsit un nou medicament împotriva tensiunii arteriale, în jumătate de timp și pentru doar 200 în loc de 500 de milioane de dolari!

Admitem că acesta a fost un exemplu al perioadei „pre-genomice”. Acum, după citirea genomului, proteomica iese în prim-plan, al cărei scop este de a înțelege rapid milionul de proteine ​​care ar putea exista în celulele noastre. Proteomica va face posibilă diagnosticarea mai amănunțită a anomaliilor genetice și blocarea efectelor adverse ale proteinelor mutante asupra celulei.

Și în timp, va fi posibil să se planifice „corecția” genelor.

Genetica medicală este un domeniu dedicat eredității, patologiilor ereditare și sănătății, tratamentului și prevenirii bolilor genetice, precum și problemelor de transmitere ereditară a predispoziției la boli.

Ce este genetica?

O parte importantă a geneticii medicale este genetica clinică, a cărei sarcină este detectarea și prevenirea patologiei ereditare.

Este dificil de supraestimat rolul geneticii în medicina modernă. După cum sa dovedit, este uriaș și chiar și cunoștințele considerabile care au fost acumulate în acest domeniu până în prezent reprezintă, conform oamenilor de știință, doar vârful aisbergului.

Astfel, medicii care efectuează cercetări au descoperit că multe tipuri de cancer sunt ereditare, în special:

• leucemie;
• majoritatea cancerelor din copilărie;
• si etc.

Noile tehnologii, daruri ale progresului științific și tehnologic, au deschis noi oportunități pentru genetică, iar dintr-o disciplină preponderent teoretică a devenit una aplicată. Decodificarea genomului uman a deschis posibilitatea de a interfera cu genomul, excluderea unor gene și activarea altora - aceasta este direcția în care se dezvoltă genetica medicală.

Unul dintre domeniile importante cu care se ocupă genetica este reproducerea. O astfel de metodă populară de tratare a infertilității precum FIV, care a devenit ferm stabilită în practica medicală, a devenit posibilă și datorită dezvoltării geneticii medicale. În plus, diagnosticul genetic este întotdeauna efectuat dacă pacientul are indicații.

Metode de genetică străină

Există următoarele metode de genetică umană:

• Genealogic. Metoda constă în urmărirea și studierea pedigree-urilor, permițând determinarea tiparelor prin care anumite trăsături sunt moștenite, inclusiv cele responsabile de boli ereditare.
• Geamănă. Metoda studiază influența mediului asupra genotipului unei persoane, comparând gemeni identici care trăiesc în condiții diferite.
• citogenetic. O metodă care constă în examinarea microscopică a cromozomilor. Cu ajutorul acestuia se determină bolile cromozomiale (de exemplu, una dintre variantele sindromului Down).
• Sechestrarea. O metodă constând în studierea ADN-ului uman la nivel molecular.
• Dermatoglific. Metoda se bazează pe studierea reliefului pielii degetelor, palmelor și picioarelor. Cu ajutorul acestuia, sunt diagnosticate o serie de patologii ereditare.
• Biochimic. Folosit pentru studiul bolilor metabolice ereditare bazate pe tulburări enzimatice.
• Metoda statistică a populației – studiul modelelor de trăsături ereditare în grupuri mari ale populației.

Diagnosticul genetic în străinătate

Consultația genetică include diagnosticul genetic. Analiza genetică ne permite să determinăm nu numai posibilitatea apariției bolilor ereditare, ci și predispoziția la o serie de boli comune.

Pentru a efectua o analiză genetică, se prelevează sânge (5 ml), în plus, se efectuează o examinare amănunțită a istoricului medical al pacientului - acest lucru este necesar pentru a interpreta corect rezultatele obținute.

Cel mai adesea, oamenii apelează la un centru genetic sau în orice altă țară dacă există anumite suspiciuni cu privire la o posibilă patologie ereditară, dacă unul dintre membrii familiei are o astfel de patologie (inclusiv un copil născut) și în timpul sarcinii, dacă există anumite indicații.

Diagnosticul genetic la femeile gravide, cu suspiciunea rezonabilă a posibilității unei patologii ereditare, se efectuează folosind metode invazive:

Tratamentul bolilor genetice în străinătate

Genetica în străinătate, datorită disponibilității echipamentelor ultramoderne și a specialiștilor instruiți, are capacități mari în diagnosticarea patologiilor ereditare de toate tipurile. Pacienții se adresează la secția de genetică fie prin trimitere de la un medic dacă există anumite indicații (de exemplu, familiile care planifică un copil, dacă există o patologie genetică confirmată la copiii deja născuți), fie la cererea lor.

Indiferent ca este vorba de un mare institut de genetica, un centru de genetica sau un departament de genetica, pacientul va primi asistenta calificata in totalitate.

Fiecare centru de diagnosticare medicală care se ocupă de FIV are și capacitatea de a efectua diagnostice genetice conform standardelor moderne – motiv pentru care printre copiii născuți prin inseminare artificială nu există practic persoane care să sufere de boli ereditare.

Costul tratamentului în centrele de genetică din străinătate

Dacă aveți nevoie de consiliere genetică, site-ul UNIMED vă invită să completați un formular de contact și să ne contactați. Vă vom oferi informații cuprinzătoare, inclusiv cu privire la costul posibil al diagnosticului și tratamentului genetic. Tot pe acest portal puteți afla informații oficiale din alte țări.

5710 0

Există un punct de vedere, împărtășit de un număr considerabil de specialiști, că toate bolile umane, cu excepția leziunilor, sunt asociate cu defecte genetice. Evident, acesta este un punct de vedere extrem, dar reflectă totuși importanța factorilor genetici în determinarea sănătății oamenilor. Defectele genetice apar în diferite grade de severitate și stare.

Deși diabetul și distrofia musculară sunt considerate în mod obișnuit boli, iar palatul despicat sau daltonismul ca defecte ereditare, toate sunt rezultatul mutațiilor din materialul genetic. De asemenea, s-a demonstrat că predispoziția la boală depinde și de constituția genetică.

Defectele genetice sau mutațiile în secvența ADN sunt exprimate în înlocuirea unei nucleotide cu alta, pierderea unui întreg fragment sau transferul acestuia într-o altă poziție a genomului etc. Astfel de modificări pot duce la modificări ale structurii (și funcției) a proteinei care este codificată de acest fragment de ADN sau la modificări ale regiunilor genice reglatoare care sunt fatale pentru celule. Când vorbim despre boli ereditare, ne referim la mutații care apar în celulele germinale și sunt transmise descendenților.

Mutațiile se acumulează și în celulele somatice de-a lungul vieții, ceea ce poate provoca boli, dar nu sunt moștenite. Anterior, se credea că toate mutațiile sunt dăunătoare. Acest lucru se datorează faptului că tocmai cu astfel de mutații care provoacă boli a început studiul caracteristicilor genetice umane. Dar acum, când aproape întregul text cu nucleotide umane a fost citit, a devenit clar că majoritatea mutațiilor sunt neutre. Mutațiile dăunătoare care duc la perturbarea gravă a dezvoltării organismului sunt eliminate prin selecție - purtătorii lor nu supraviețuiesc sau nu produc descendenți.

Progrese enorme în înțelegerea modului în care genele moștenite influențează caracteristicile fizice și psihologice ale unei persoane s-au produs în ultimele decenii datorită descoperirilor făcute în studiul genomului uman. O serie de boli genetice, precum și predispoziția la acestea, au fost identificate și diagnosticate și în stadiile foarte incipiente ale dezvoltării embrionului. Marile speranțe pentru extinderea capacităților medicinei moderne sunt asociate cu implementarea Proiectului Genomului Uman.

Implementarea proiectului științific „Genom uman”

Proiectul științific al genomului uman este un program internațional al cărui scop final a fost determinarea secvenței de nucleotide (secvențierea) întregului ADN genomic uman, precum și identificarea genelor și localizarea lor în genom (cartografiere). În 1988, Departamentul de Energie al SUA și Institutul Național de Sănătate din SUA au introdus un proiect amplu care a inclus secvențierea genomului oamenilor, precum și a bacteriilor, drojdiilor, nematodelor, muștelor fructelor și șoarecilor - organisme care au fost utilizate pe scară largă ca sisteme model. în studiul geneticii umane.

Congresul a alocat 3 miliarde de dolari pentru implementarea acestui proiect. (un dolar pentru fiecare nucleotidă a genomului uman). Laureatul Premiului Nobel James Watson a fost numit director de proiect. Alte țări s-au alăturat proiectului - Anglia, Franța, Japonia etc.

În 1989, la inițiativa academicianului A.A. Baev, în țara noastră a fost organizat un consiliu științific pentru programul „Genom uman”. În 1990, a fost creată Organizația Internațională a Genomului Uman (HUGO), al cărei vicepreședinte a fost timp de câțiva ani academicianul A.D. Mirza-beyov. Indiferent de contribuția și afilierea națională a participanților individuali la program, încă de la început, toate informațiile primite în timpul lucrului au fost deschise și accesibile tuturor participanților săi.

Douăzeci și trei de cromozomi umani au fost împărțiți între țările participante. Oamenii de știință ruși au fost nevoiți să studieze structurile cromozomilor al 3-lea și al 19-lea. Cu toate acestea, în curând finanțarea pentru acest proiect a fost mult redusă, iar țara noastră nu a luat nicio parte reală în secvențiere. Cu toate acestea, lucrările la proiectul genomic din țara noastră nu s-au oprit: programul a fost revizuit și axat pe dezvoltarea bioinformaticii - metode matematice, tehnologie computerizată, software, îmbunătățirea metodelor de descriere și stocare a informațiilor genomice care ar ajuta la înțelegerea și înțelegerea decriptate. informație.

A fost nevoie de 15 ani pentru a descifra genomul uman. Cu toate acestea, dezvoltarea constantă a tehnologiei de secvențiere a permis ca proiectul să fie finalizat cu 2 ani mai devreme. Compania privată americană Celera, condusă de J. Venter (fost biolog la National Institutes of Health din SUA), a jucat un rol semnificativ în intensificarea muncii. În timp ce în primii ani ai proiectului, câteva milioane de perechi de nucleotide au fost secvențiate în întreaga lume pe an, până la sfârșitul anului 1999 Celera descifra cel puțin 10 milioane de perechi de nucleotide pe zi. Pentru a realiza acest lucru, s-a lucrat non-stop în regim automat de către 250 de instalații robotizate, informațiile au fost imediat transferate în băncile de date, unde au fost sistematizate, adnotate și postate pe internet.

Lucrând în 1995, Venter și coautorii săi au dezvoltat și publicat o abordare complet nouă a secvențierii genomului numită secvențierea aleatorie a întregului genom (mai bine cunoscută sub denumirea de secvențiere fracțională aleatorie), care a permis asamblarea unui genom complet din fragmente de ADN secvențiate parțial folosind un computer. model .

Această metodă a fost prima care a secvențat complet genomul unui organism cu viață liberă autoreplicabilă - bacteria Haemophilus in-fluenzae Rd. Copii ale ADN-ului bacterian au fost tăiate în bucăți de lungime arbitrară de la 200 la 1600 bp. Aceste fragmente au fost secvențiate de câteva sute de la fiecare capăt. În plus, au fost secvențiate fragmente mai lungi de 15-20 kb. Secvențele rezultate au fost introduse într-un computer, care le-a comparat, le-a distribuit în grupuri și în funcție de similitudine.

Secvențele nerepetitive au fost identificate mai întâi, urmate de secvențe de fragmente repetate. Fragmentele lungi au ajutat la stabilirea ordinii secvențelor repetate frecvent, aproape identice. Golurile dintre bucățile majore de ADN rezultate au fost apoi umplute. Secvențierea genomului Haemophilus influenzae a durat un an și a fost determinată secvența de 1.830.137 bp. și 1.749 de gene situate pe 24.304 fragmente.

A fost un succes fără îndoială și a dovedit că noua tehnologie poate fi aplicată pentru a secvenționa rapid și precis genomuri întregi. În 1996, a fost cartografiat genomul primei celule eucariote, drojdia, iar în 1998, genomul unui organism multicelular, râmele rotund Caenorhabolits elegans, a fost secvențiat pentru prima dată.

În februarie 2001, o versiune de lucru a genomului uman (90% finalizată) a fost publicată simultan în revistele „Nature” - rezultatele HUGO și „Science” - rezultatele cercetării Celera. Analiza variantei rezultate a genomului uman a relevat aproximativ 25 de mii de gene. Anterior se presupunea că acest număr ar trebui să ajungă la 140 de mii (pe baza postulatului „o genă codifică o proteină”). În prezent, se pare că o genă poate codifica 5-6 proteine. Diversitatea proteinelor codificate de aceeași genă este asigurată de mai multe mecanisme: prin splicing alternativ, transformări post-translaționale ale proteinelor - fosforilare, acetilare, metilare, glicozilare și multe altele.

În 2003, a fost publicată secvența finală completă a genomului uman. Toate aceste informații sunt disponibile și pot fi găsite pe internet pe mai multe site-uri. Cu toate acestea, unele elemente ale genomului nu sunt încă susceptibile de secvențiere cu tehnologiile moderne, iar cunoștințele noastre despre genom rămân incomplete. S-a dovedit că doar 30% din genom codifică proteine ​​și este implicat în reglarea acțiunii genelor.

Care sunt funcțiile regiunilor rămase ale genomului și dacă acestea există, rămâne complet neclar. Aproximativ 10% din genom constă din așa-numitele elemente Alu, lungi de aproximativ 300 bp. Au apărut de nicăieri în cursul evoluției doar printre primate. Odată ce au ajuns la oameni, s-au înmulțit la jumătate de milion de copii și au fost distribuite de-a lungul cromozomilor în cel mai bizar mod.

În ceea ce privește regiunile codificatoare ale ADN-ului, într-o analiză computerizată pur moleculară acestea au fost numite gene după criterii pur formale: prezența semnelor de punctuație necesare citirii informațiilor și sintetizării unui produs genetic specific. Cu toate acestea, momentul și acțiunea majorității genelor potențiale este încă neclară și poate dura cel puțin o sută de ani pentru a determina funcțiile lor.

PE. Voinov, T.G. Volova